如何识别并避免免疫分析中的干扰？( 五 ) 免疫分析法是使用抗体检测不

文章图片
图3:Westernblotting法检测细胞角蛋白4、5和6 。图中显示了实验中使用LowCrossBuffer?和TTBS检测的效果对比。 LowCrossBuffer?可以完全防止不必要的结合。细胞角蛋白4、5和6在56-60kDa之间，使用LowCrossBuffer?可清晰地被检测到。泳道1和1'样本来自肝细胞，泳道2和2'样本来自Hela细胞。 M为分子量marker ，用酰胺黑染色。印迹膜是硝酸纤维素膜porablotNCP 。
图4显示了基质效应如何影响ELISA 。通过这种模型分析（由CandorBioscience公司开发），系统地诱导了基质效应。用兔血清作为基质，加入一定浓度的C反应蛋白。使用捕获抗体(cloneC2,1μg/ml))和生物素化检测抗体（cloneC6,2μg/ml）。加入的血清样品分别用PBS-BSA缓冲液或LowCross-Buffer?按照1：2进行稀释，用ELISA检测。通过加入辣根过氧化物酶结合物及TMB底物进行检测。

文章图片
图4:ELISA法检测家兔血清中的CRP 。 LowCross-Buffer?通过去除基质效应来提高灵敏度。
基质效应的确切分子基质未知，它会导致校准曲线的灵敏度变差。 CRP蛋白由于其生理特征，能够结合许多蛋白质和其他物质，可能显著降低表位的可用性。虽然不能排除图1(I-L)中所示的干扰效应发生的可能，但大概率会发生图1(L)所示的干扰效应。 LowCrossBuffer?可防止CRP与兔血清内源性物质结合，从而将校准曲线的灵敏度提高3倍。
图5是用于豚鼠免疫毒理学研究的抗豚鼠免疫球蛋白的ELISA示例。在本试验中，特异性对照（A1-A12行）和空白值（H1-H12）的假阳性结合破坏了数据评估。 LowCrossBuffer?的使用防止了假阳性信号，而且使B至G行1-6或B至G行7-12的浓度检测成为可能。使用山羊抗豚鼠IgGF（ab'）2作为捕获抗体，并使用生物素化的山羊抗豚鼠IgG（Fcγ）作为检测抗体。豚鼠IgG用LowCrossBuffer?或PBS进行稀释。 PBS-BSA缓冲液用作封闭缓冲液。用链霉亲和素过氧化物酶和邻苯二胺进行检测。

文章图片
图5:在用豚鼠IgG进行ELISA实验中，通过使用LowCross-Buffer?防止假阳性结合（A1-12行为对照组， H1-12为空白组）。
结论
免疫分析中用于生物分析和诊断目的的抗体的使用，同时伴随着干扰现象的产生。在过去30年赵成成干扰的多种分子机制被发现，人们对其进行评估，从而制定预防策略。在当今的技术发展水平上，许多干扰影响都可以最小化，而LowCrossBuffer?对此做出了重要贡献。 LowCrossBuffer?可使不同分子原理的不同干扰效应最小化，适用于不同的免疫分析。此外， LowCrossBuffer?还可以防止HAMAs和类风湿性因子的干扰效应、免疫组织化学应用中的非特异性结合以及免疫PCR中的假阳性条带。总之，优化实验所需的时间和成本可以大大减少和简化，同时提高可靠性。
文献引用
[1]Jerne,N.K.,Science229(1985),1057-1059
[2]Kaplan,I.V.,Levinson,S.S.,ClinicalChemistry45:5(1999),616-618
[3]Miller,J.J.,ClinicalLaboratoryInternational28,2(2004),14-17
[4]Selby,C.,AnnClinBiochem36(1999),704-721
[5]Patton,W.F.,Electrophoresis21(2000),1123-1144
[6]MacBeath,G.,Nat.Genet.32(2002),526-532
[7]Kusnezow,W.,Hoheisel,J.D.,J.Mol.Recognit.16(2003),165-176
[8]Miller,J.J.,Valdes,R.Jr.,JClinImmunoassays15(1992),97-107
[9]Wood,W.G.,Scand.J.Clin.Lab.Invest.Suppl.205(1991),105-112
[10]Kricka,L.J.,ClinicalChemistry45:7(1999),942-956
[12]Span,P.N.,GrebenchtchikovN.,Geurts-Moespot,J.,Sweep,C.G.J.,ClinicalChemistry49:10(2003),1708-1709