如何识别并避免免疫分析中的干扰？( 四 ) 免疫分析法是使用抗体检测不

钩状效应
钩状效会导致假阴性结果，但与其他干扰效应不同的是，它不是通过与干扰因素的相互作用而产生。
免疫分析时，当样本与分析抗体直接混合，且分析物的浓度非常高时，钩状效应就有可能发生。在这种情况下，当分析物的高浓度超过分析抗体的浓度时，捕获抗体和检测抗体会出现饱和。因此高浓度被判读为远低于实际的低浓度，从而导致对真实浓度的显著低估。在实践中，通过使用更高浓度的检测抗体或者稀释样本，可以避免钩状效应。或者，必须对实验进行系统化稀释，以确保检测值不受钩状效应的影响。已知的可能受到钩状效应影响的临床参数有：CRP、AFP、CA125、PSA、铁蛋白、催乳素及TSH等。
使用LowCrossBuffer?防止干扰
造成所描述的干扰效应的原因是相似的。干扰因子与抗体或分析物之间存在不必要的从低到中的亲和作用。标记抗体与其他蛋白质或表面的低亲和力结合或中亲和力结合，同样抗体与结构相关物质低到中亲和交叉反应。 LowCrossBuffer?利用了这些干扰效应的共同之处：干扰反应弱于真实分析物的特异性结合。当然，很少有因发生非常高的亲和的交叉反应，达到与真正特定性结合相同的结果。在这种情况下，人们必须谈论一个特定的结合，并且在原则上有一个针对两种不同物质的抗体。因此，这种抗体根本不能用于特定的分析。 LowCrossBuffer?是专门开发来消除低和中亲和力结合，但不会对高特异性的高亲和力结合产生任何负面影响。
图2到图5显示使用LowCrossBuffer?可防止免疫分析中典型的干扰效应的不同示例。图2显示了在蛋白芯片应用中使用LowCrossBuffer?可降低高背景，并将信噪比从3.4提高到17.3 。在这个实验中，对不同多克隆抗EPIL抗体(EPIL=早期胎盘胰岛素样生长因子)的适用性进行了测试。抗体使用浓度为500μg/ml、体积为1.8nl/spot通过生物芯片打点机（GMS417）固定在氨基硅烷化的微阵列载玻片上。随后，将2ml的EPIL过度表达细胞系（SKBR3）培养基与染料Oyster650P混合，此时培养基内蛋白质被标记。分别使用LowCrossBuffer?和PBS按照1：20稀释培养基，加在载玻片上进行孵育。冲洗载玻片后，用荧光扫描仪（GMS418）进行读取，并用ImaGene分析数据。通过使用LowCrossBuffer?可以明显降低背景信号，从而使得更好地区分单个抗体是否适用于检测EPIL 。

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图2:减少检测抗体与蛋白质芯片表面的非特异性结合。通过使用LowCross-Buffer? ，将信噪比从3.4提高到17.3 。 (数据源自N.Dankbar,universityofMünster)
图3显示用westenblotting法检测来自肝细胞和HeLa细胞的角蛋白4、5和6 ，其中通过交叉反应非特异性结合检测到比正确条带更多的条带。蛋白质样品在12.5%SDS-聚丙烯酰胺凝胶上电泳跑样，然后印迹到硝基纤维素膜上。蛋白质样本中的细胞角蛋白的westenblotting检测方法采用改进的标准流程。抗细胞角蛋白抗体用LowCrossBuffer?或TTBS（Tween-Tris缓冲盐水）按照1：2500比例稀释，用碱性磷酸酶标记的二抗进行检测（二抗用LowCross缓冲液?或TTBS按照1：1250比例进行稀释），再加入底物BCIP/NBT显色。如果没有LowCrossBuffer?的帮助，很难揭示非特异性结合反应的确切分子原因。由于其他细胞角蛋白及其裂解产物或与肝脏或HeLa细胞的细胞破裂产生的不同蛋白质的非特异性结合，可能导致交叉反应发生。用LowCrossbuffer?替换TTBS ，稀释一抗和二抗，可以将非必要的结合减少，细胞角蛋白只在56-60kDa的正确分子量区域内被染色。