PCR基因扩增原理,pcr技术的原理和步骤？

PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的退火(复性)：
【PCR基因扩增原理,pcr技术的原理和步骤？】

模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍

文章插图
pcr技术的原理和步骤？
PCR技术原理和操作
PCR技术是指，在DNA聚合酶催化下，以母链DNA为模板，以特定引物为延伸起点，通过变性、退火、延伸等步骤，体外复制出与母链模板DNA互补的子链DNA的过程。
一、PCR技术的基本原理和操作
1、PCR反应的成分和作用
总体积：一般为25μl～100 μl
（一）Mg2+:终浓度为1 。5～2 。0mmol/L，其对应dNTP为200 μmol/L，注意Mg2+与dNTPs之间的浓度关系，由于dNTP与Taq酶竟争Mg2+，当dNTP浓度达到1 mmol/L时会YZTaq酶的活性。Mg2+能影响反应的特异性和产率。
（二）无Mg2+buffer：由纯水、kcl、Tris组成。Tris用于调节反应体系pH值，使Taq酶在偏碱性环境中反挥活性。kcl可降低退火温度，但不能超过50 mmol/L，否则会YZDNA聚合酶活性。
（三）BSA：一般用乙酰化的BSA，起着减少PCR管对Taq酶的吸附作用，对Taq酶有保护作用。
（四）底物（dNTPs）：dNTPs具有较强酸性，其储存液用NaOH调pH值至7 。0～7 。5，一般存储浓度为 10 mmol/L，各成份以等当量配制，反应终浓度为20～200μmol/L 。高浓度可加速反应，但同时增加错误掺入和实验成本；低浓度可提高精确性，而反应速度会降低。
（五）Taq酶：能耐95℃高温而不失活，其Z适pH值为8 。3～8 。5，Z适温度为75～80℃，一般用72℃ 。能催化以DNA单链为模板，以碱基互补原则为基础，按5’→3’方向逐个将dNTP分子连接到引物的3’端，合成一条与模板DNA互补的新的DNA子链。无3’→5’的外切酶活性，没有校正功能。某种dNTP或Mg2+浓度过高,会增加其错配率。用量一般为0 。5～5个单位/100μl 。
（六）模板：PCR对模板DNA的纯度不要求很高，但应尽量不含有对PCR反应有YZ作用的杂质存在，如蛋白酶、核酸酶、TqaDNA聚合酶YZ剂、能与DNA结合的蛋白质。模板DNA的量不能太高，否则扩增可能不会成功，在此情况下可适当稀释模板。
（七）引物：引物浓度一般为0 。1～0 。5μmol/L，浓度过高会引起错配和非特异扩增，浓度过低则得不到产物或产量过低。引物长度一般15～30个碱基，引物过长或过短都会降低特异性。其3’末端一定要与模板DNA配对，末位碱基Z好选用A、C、G（因T错配也能引发链的延伸）。

引物G+C约占45～55%，碱基应尽量随机分布，避免嘧啶或嘌呤堆积，两引物之间不应有互补链存在，不能与非目的扩增区有同源性。

2、PCR反应步骤和反应条件选择（影响因素）
a、变性：模板变性完全与否是PCR成功的关键，一般先于94℃（或95℃）变性3～10min，接着94℃变性30～60s 。
b、退火：退火温度一般低于引物本身变性温度5℃ 。引物长度在15～25bp可通过公Tm=(G+C)×4℃+(A+T)×2℃计算退火温度，一般退火温度在40～60℃之间，时间为30～45s 。如果(G+C)低于50%，退火温度应低于55℃ 。较高的退火温度可提高反应的特异性。
c、延伸：延伸温度应在Taq酶的Z适温度范围之内，一般在70～75℃ 。延伸时间要根据DNA聚合酶的延伸速度和目的扩增片段的长度确定，通常对于1kb以内的片段1min是够用的。
以上述三个步骤为一个循环，每一循环的产物均可作为下一个循环的模板，经过n次循环后，目的DNA以2n的形式增加