2021年7月19日|突变愈伤组织靶位点的一代测序 2021年7月19日

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2021年7月19日，中国科学院新疆生态与地理研究所张道远课题组在PlantMethods上发表了题为“ApplicationofCRISPR/Cas9technologyinwildapple(Malussieverii)forpairedsitesgeneediting”的研究论文。
野苹果原产于中亚山脉，广泛分布在天山山脉的野生果林中。据统计，野苹果林约占中国天山山脉果林的92% 。许多遗传学研究表明，野苹果是现代栽培苹果的原始祖先，为研究现代栽培苹果提供了资源。然而，在过去的20年里，天山森林中的野苹果树受到了生物胁迫和人类活动的严重破坏。因此，对这一宝贵果树种质的有效保护以及创制新的抗逆种质势在必行。
由于野苹果的自交性以及成熟时间长，常规育种方式不能轻易满足迫切的需求。该团队利用CRISPR/Cas编辑系统来对新疆野苹果基因组进行了编辑，并首次实现同时编辑两个靶点。在这项研究中，该团队通过使用两个不同的系统，构建了具有靶向MsPDS基因的配对sgRNAs的8种不同载体，并成功获得了一些突变的愈伤组织和芽。这是CRISPR/Cas9基因编辑系统在该物种中的首次成功应用，将为该物种的基因功能研究、利用和保护提供有力的技术支持。

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图1.MsPDS基因的结构、靶点选择和Cas9/sgRNA载体示意图。（A）MsPDS基因的结构，黑色矩形代表不同的外显子。（B）不同外显子的靶位点，黄色数字是外显子的位置，红色文本为PAM 。（C）CRISPR/Cas9和pTG-CRISPR/Cas9系统的配对sgRNA/Cas9双元载体的载体ID 。（D）CRISPR/Cas9和pTG-CRISPR/Cas9系统的sgRNA表达载体示意图，不同颜色的菱形框代表sgRNA ，矩形框代表sgRNA骨架，紫色圆角矩形代表tRNA 。

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图2.突变愈伤组织靶位点的一代测序。（A-D）左：由pYL-①、pYL-②、pTG-③和pTG-④转化的愈伤组织。右：突变类型和测序图谱。红色箭头：编辑了MsPDS产生的一些白化愈伤组织。
表1野苹果愈伤组织中位点特异性突变率统计

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【2021年7月19日|突变愈伤组织靶位点的一代测序】图3靶位点的突变位点和一代测序。（A-B）左：分别由pYL-②和pTG-④转化的芽。右：突变类型和测序图谱。红色箭头：编辑了MsPDS产生的白化部分。