简述重组dna技术的基本过程 dna重组技术的研究综述 _dna重组技术的研究综述

生物化学实验题(高手或老师进)急!!!!!!!!
(1)原核大肠杆菌DNA聚合酶1)DNA聚合酶I.在接下来的链合成中，首先合成了许多冈崎片段，然后由于RNA引物的去除而形成缺口。此时，DNAPol催化聚合反应并延伸每个片段，从而填补了片段之间的空隙，使上述片段相互靠近，为片段与长链连接创造了条件。因此，DNApol的聚合主要起到填补从动链各段之间空隙的作用。Pol还具有35核酸外切酶活性，可以识别和去除错误的碱基。这项活动在DNA复制中起到校对的作用。POL的校对活性对DNA复制的准确性起着重要作用。Pol还具有53核酸外切酶活性。53核酸外切酶的活性也具有纠错功能，补充其35核酸外切酶以纠正错误。例如，紫外线照射产生的嘧啶二聚体被其53裂解酶切除。POL结构中的不对称二聚体分别催化主链和从链的合成。Pol还具有35核酸外切酶活性，因此对DNA复制也具有校对功能，可以停止添加或去除错误的核苷酸，然后继续添加正确的核苷酸。因此，dnapol联合DNAPolI可以将复制的错误率从10-4大大降低到10-6以下。当该片段与前一片段接近时，RNA引物被DNAPOL的53核酸外切酶活性切除，产生片段间的空隙。然后，DNA里坡在53方向催化聚合，填补了片段间的空白。(2)真核DNA聚合酶。真核生物的DNAPol有5种：、、、和。真核生物的DNA复制是由DNA聚合酶和DNA聚合酶的相互作用催化的，一些酶和蛋白质因子参与反应。脱氧核糖核酸Pol和引发剂一起起引发作用，然后脱氧核糖核酸Pol催化前导链和跟随链的合成。脱氧核糖核酸Pol是线粒体中的一种脱氧核糖核酸复制酶。Pol和都具有核酸外切酶活性，因此它们还具有编辑功能来纠正复制中的错误。它们的53核酸外切酶活性可能在引物RNA的切除中起作用。(2)真核DNA聚合酶。真核生物的DNAPol有5种：、、、和。活性53聚合35外生http://bioinfo.cau.e.cn/bio_base/biochemistry.htm
动物克隆技术的综述怎么写
克隆这个词是从克隆音译而来的。在音译名出现之前，就有了音译名——无性繁殖系，是指通过单细胞或共同祖先的有丝分裂获得的细胞群或有机群。我们可以通过细胞培养获得细胞克隆。克隆技术简史(资料不多)1938年，第一位现代胚胎学家、德国的汉斯斯皮尔曼博士提出，哺乳动物的克隆应该通过将成熟的细胞核植入卵子来进行。1952年，利用斯皮曼的想法，世界上第一只克隆青蛙出现了。1962年，王渊源宣布他从一个成熟的细胞中克隆了一只蝌蚪，这引发了关于克隆的第一场辩论。1984年，斯汀威拉德森用胚胎细胞克隆了一只羊。这是第一个被证实的克隆哺乳动物。1995年10月，来自美国马萨诸塞州的麻醉师维坎蒂博士，利用改良的组织工程，使人的耳朵长在老鼠的背上，这样人类就可以在实验室培养出可以移植到人类身上的皮肤和软骨。1996年7月，英国苏格兰罗斯林研究所从绵羊乳腺细胞中成功克隆出绵羊多莉。1997年10月，英国专家研制出无头青蛙胚胎，使相关技术能够制造人体器官用于医学移植。1999年7月，日本科学家克隆了许多牛，并将它们的肉投放市场。2000年4月，美国先进细胞工程公司克隆了6头比实际年龄小的小牛。2000年，美国科学家通过无性繁殖技术成功克隆了一只猴子‘Tetra’，这意味着克隆人类本身不存在技术障碍。2001年11月25日，马萨诸塞州的一家生物技术公司成功克隆了人类胚胎，这是克隆技术的重要一步。然而，该公司表示，其目的不是克隆人类，而是获得可用于治疗帕金森综合征和青少年糖尿病等各种疾病的干细胞。什么是克隆？克隆这个词是从克隆音译而来的。在音译名出现之前，就有了音译名——无性繁殖系，是指通过单细胞或共同祖先的有丝分裂获得的细胞群或有机群。我们可以通过细胞培养获得细胞克隆。在微生物学实验中，我们可以把盘子倒下去，一个一个地得到菌落，其实就是细菌克隆。可见，克隆原本是一个名词，指的是一组细胞或个体。随着分子生物学的发展，出现了核转移、基因工程等操作。核移植可以获得重建的细胞，这些细胞可以繁殖成克隆。基因工程可以将选定的基因剪接到质粒的复制子中，通过复制子的复制可以获得DNA分子的克隆。所以有人称这种操作为克隆，即克隆一词由名词改为动词，核转移称为核克隆，基因工程获得的DNA分子克隆称为分子克隆。这里的克隆是一种实现无性繁殖的操作，是一种微观操作或分子生物学操作，而不是一般意义上的无性繁殖(或无性繁殖操作) 。也许这就是克隆这个词能够存在而不被无性繁殖取代的原因。克隆羊多莉，也叫克隆羊，实际上是一只通过核克隆技术生产出来的羊。有人说多莉羊才是真正的克隆羊。其他报道，如克隆猪和克隆牛，不是真正的克隆，因为它们是由胚胎细胞发育而来的，而胚胎细胞是通过有性生殖产生的。这是一种误解，是由性过程的时机不准确造成的。当受精卵，即受精卵形成时，性过程结束。一旦合子分裂开始，就与性过程无关了。
关了。如果说分裂后的胚胎细胞是有性繁殖产生的，那么，体细胞追究下去也是有性繁殖产生的。但事实上它们都是由合子经有丝分裂逐渐产生的。这就是说，有性繁殖实际上是经过一次有性过程和许多次无性过程，最后产生一个成活的后代而实现的。从胚胎中取出一个细胞使之发育成一个个体，这显然应属于无性繁殖。所以，从这个意义上讲，杜里舒是克隆技术（细胞克隆技术）的创始人，他的将两分裂球时期的细胞分开，使之发育成两个海胆的实验，是最早的克隆实验。而人类的同卵双生双胞胎，就是经天然细胞克隆化产生的。而克隆猪、克隆牛，如果是经核移植育成的，则不管供核细胞是来自早期胚胎细胞，还是已分化细胞，均属于真正意义上的克隆技术，而且是比杜里舒的水平高得多的克隆技术。走近"基因药物人们为了实现某种目的，将克隆的外源目的基因(一般是人的DNA )，整合到动物受精卵的染色体内，使之在动物体内得到表达并能稳定地遗传给后代，这种含有外源基因的动物就叫做转基因动物。从事这项研究的科学家们说，一头转基因动物就是一座天然基因药物制造厂，不仅可以大大降低成本，而且还能够扩大生产，获得更多的基因药物。利用转基因动物来生产基因药物是一种全新的生产模式，与传统的制药技术相比具有无可比拟的优越性。以美国为例，凝血因子Ⅷ的年需要量约为120 克。过去，这120克凝血因子Ⅷ需要120万升血浆提取，以每人献血200 毫升计，需600 名献血员提供血浆才能满足。而用转基因牛来生产，一头牛每年的奶产量是1万公斤，如每公斤乳汁中可制造10毫克凝血因子Ⅷ的话，那就只需1.2头这种牛即可满足需要。再以白蛋白为例，美国的年需要量为10万克，过去需从200 万升血浆中提取，而用转基因牛来生产，以每公斤乳汁制造2 克的蛋白计算，就只需5000头牛即可解决。此外，从人血中提取血清蛋白质可能产生的肝炎、艾滋病等传染性疾病，也可因此而得以避免。生物技术是当今最为活跃的一门技术。1971年，诺贝尔奖获得者保罗?伯格首次成功地把两种不同的基因拼接在一起，使生物技术发展到基因重组与移植的新阶段。此后，基因重组技术取得了一个个丰硕成果。1978年合成了人工胰岛素，1979年实现了生长激素基因在大肠杆菌中的表达，1982年研制成功了人工干扰素，基因制药从此走上了产业化道路。但是，目前的基因药物是通过基因重组技术培育大肠杆菌和动物细胞来制造的，而大肠杆菌这类低等生物是不可能生产出结构复杂的药物，动物细胞培养的成本又太高。所以，利用基因重组与移植技术来培育转基因动物生产药物便应运而生了在利用转基因动物提取药物方面，英国科学家首开先河。1997年年底，英国PPL治疗学公司率先利用克隆"多利"所采用的"细胞核转变"法，培育出200头携带人体基因的绵羊，并成功地从奶汁中提取了α－1抗胰蛋白酶。这是科学家首次从遗传工程培育的绵羊的奶中，提取可用于治疗人类疾病的药物成分，为建立"动物药厂" 打下了基础。随后，芬兰科学家将人体的促红细胞生长素基因，植入乳牛的受精卵中，创造了一种能生产出促红细胞生长素的乳牛。从理论上说，这种乳牛一年可提取60－80千克促红生长素，比目前全世界的使用量还多。假如你是足球迷，你肯定希望世上再多一个罗纳尔多；假如你是音乐爱好者，你当然愿意再拥有一个贝多芬；再有一个爱迪生、爱因斯坦也是许多人所梦想的。古希腊有位哲学家曾经说过"世上不可能有两片完全相同的叶子"，换句话，以上的梦想都只能是空想，没有实现的可能。但是，现在情况却有了变化，有一种新兴生物技术"克隆"，或许可以做到这一点。那么克隆是什么呢?它奇妙在哪里呢?今天，就让我们一起走近——"奇妙的克隆" 。我们身边哪些动、植物先天具有克隆的本领？具有克隆能力的动植物有：土豆、蚯蚓、桑树，丝瓜藤,吊兰.水母，海参、仙人掌。水母在遭到伤害后，伤口会自动补好。章鱼的触手可以再生。龙虾的大钳子掉了，还会再长出来。还有秋海棠、富贵竹，它们插枝即活。壁虎。它遇到危险时，就将自己的尾巴断掉，然后再长出来。能不能找出这些天生具有克隆本领的动植物的共同点，用自己的话说说克隆是什么?不由生殖细胞结合产生的后代。克隆技术可以造福于人类：能使不具备繁殖能力的动物诸如骡扩大繁殖，还能挽救濒危动物。假如你也掌握了克隆技术，你想克隆什么呢？为什么要克隆它？要求：1、想法要奇妙；2、想法要有益于人类；3、表达要有条理，语气、语调适当。如果让我克隆，我会克隆无数对明澈的眼睛。许多人认为有一双好眼睛是理所当然的事，而我并不这么认为。当你看到那毫无光芒的双眼，听到期盼光明的心灵的呼唤，难道你的心灵没有震动吗？上天对他们不公，就让科学来为他们创造光明，就让社会让他们体会真爱。我坚信"科技以人为本"并不是空话。所以我要克隆眼睛，让更多的人重见光明. 我想克隆恐龙。因为我喜欢恐龙，想再现恐龙时代的盛景。而且具备克隆恐龙的条件，因为恐龙时代的南极有可能处在温带地区，当恐龙死后尸体藏在南极中，而此时的南极很可能已在冰天雪地中，由于寒冷可防止身体的腐化，所以可以提取恐龙的DNA，从而克隆恐龙，这样也可以使后代开阔眼界。我不主张象他那样去克隆一些史前生物，如恐龙、猛蚂等。因为任何生物的生存与灭绝都不是人类所能控制的，人类应该严格遵守"自然法则"，让生物的发展顺其自然。如果再回到从前，就可能破坏生态平衡。我想克隆水，目前世界上的淡水资源严重缺乏，已无法维持人类生存，而人类仍在无限制地浪费水，所以我想克隆水。我要克隆粮食，拯救非洲正在挨苦受饿的人们，使他们过上温饱的日子。我们都知道，热带雨林是地球之肺。而亚马逊平原是世界上最大的热带雨林，占地球上热带雨林总面积的50%，达650万平方公里。这里自然资源丰富，物种繁多，被称为"生物学家的天堂" 。然而，亚马逊却没有因为它的富有得到人们的厚爱。70年代以来，人们的滥砍滥伐使其三分之一的面容消失在我们眼前，这将意味着维持人类生存的氧气将减少五分之一。所以，我想克隆亚马逊热带雨林，将其安放在撒哈拉沙漠上，使之净化环境。我反对刚才三位同学的说法。他们的想法很好，表达了他们忧国忧民之心，表达了他们的美好愿望。可是水、热带雨林、粮食没有细胞，如何克隆？（众笑）（有人小声插话）：水可以的，有水分子。如果我有克隆的技术，我会克隆孙悟空，因为他无所不能，可以实现我们很多改变社会的理想。（众大笑）师：感谢这些同学给大家带来的大胆的、新奇的"克隆理想"，不管它们符不符和科学原理，但都表现了大家的美好愿望，希望科技能来社会的进步，使人类的生活更幸福！围绕"克隆技术造福人类?!"的辩题展开讨论。) 师：辩论要求：(1)语言清晰、流畅，声音洪亮；（2）观点鲜明，论据充足；(3)驳斥对方观点时既要有"理"，又要有"礼" 。（以"克隆技术能造福人类"为正方，"克隆技术不能造福人类"为反方展开辩论）正方：我认为"克隆技术能造福人类"，课文的第四章节不是非常详细地介绍了克隆对人类的作用吗？如能使不具备繁殖能力的动物扩大繁殖，据有关报道，公驴和母马所生出来的杂种动物——骡，如何繁殖这些优良品种呢？只能用克隆。还能挽救如熊猫这类繁殖能力低的濒危动物。反方：我觉得克隆无益于人类。你别不相信，请听我慢慢道来。（停顿，由于太激动，又重复了一遍，众笑）首先克隆正如正方辩友所说，的确可以挽救濒危动物，但你可曾想到，这样的克隆会破坏动物种群的正常发展，使动物走向衰弱，就算可以救一时，难道可以救一世吗？我想不可能。有人说克隆可以使动植物再生，有没有想过，只要人类不刻意破坏，这样的生态平衡已维持了千万年，你这样无限制的克隆，是否破坏了它的食物链，又是另一种生态平衡的破坏呢？正方：我听说在亚马逊的热带雨林中每天都要消失近百种植物，所以克隆能挽救一部分植物，虽然不是全部，但仍能部分保存。现在的克隆技术虽然不是十分发达，但我相信今后克隆水平会更好，这时克隆就有它的用武之地了，总不能等到地球全部荒芜才研究克隆吧？反方（冷笑）：对方辩友真是对未来充满希望啊！可是这也证明了这只是你的美好想象，寄希望于克隆技术的提高，而事实上呢，经过了247次失败后，才得到了"多利"克隆小绵羊。在这个过程中需要伤害多少动物啊，这与我们克隆的初衷不是背道而驰吗？正方：失败乃成功之母嘛！（众笑）现在的克隆技术或许不发达，但在今后我相信人类的克隆水平会越来越好，克隆出来的动植物会越来越优异，象失败247次这样的事将不再发生，它最终会造福于人类。而且克隆对于研究有些疾病和研究人的寿命有不可低估的作用。当某一天我们自身的某个器官出了问题，就可以从先前克隆的胚胎中取出这个器官进行培养，然后替换自己病变的器官。我们就再也不必害怕疾病了。所以克隆对人类还是有益的。反方：你还嫌世界上的人口不多吗？如果一有严重的疾病就换器官，人不是都可以长生不老？如果这样，地球人口增长率岂不达到极点，地球不就要出现危机了吗？正方：或许那时人们可以到其他星球中生活了！（众笑）反方：我想说说克隆人有哪些危害。（反方同学鼓掌）比如，如果克隆的供体细胞发生变异，或者培养胚胎的培养基因与科学家开了小小的玩笑，克隆出一个废品，我们能象对待阿狗阿猫那样处置他们吗？器官移植，供体匮乏，能不能未雨绸缪，为自己克隆一个器官仓库，以供将来不测之需？如果能，人们能够坦然从与我们一样五官齐全，表情丰富的克隆人身上摘下一只肾，挖走有一只眼吗？人类早就期望借助机器人，从繁重或危险的劳动中解脱，但再灵巧的机器人也是笨拙难如人意。能不能克隆一个"我"的替代品，赋予他灵巧的四肢和绝对服从的意志？如果那样，是不是有一天觉醒的克隆人会向我们呐喊："王侯将相，宁有种乎？"（反方同学热烈鼓掌，并大声叫好）依样画葫芦克隆出的一个新生命，他们是儿子，还是弟弟？如果面对一群面貌、体态、风姿一样的克隆人，我们如何确认他们的身份？如果他们犯罪，我们又有什么手段缉拿真凶？再说，人类居住的地球早已因为人口爆炸难堪重荷，我们还有什么理由用另一种方法生产自身？（再次响起掌声）正方（激动地）：事物总有它的两面性，你不能十分果断地判断它是好是坏。我认为一个技术存在就一定有它存在的理由。你不能否认它有对人类造福的一面，不能将它一棍子打死。克隆技术能否为人类造福是要看它克隆的对象是什么，在什么领域，它固然有坏处，是因为任何事都有它的双面性，不能是纯粹的好与坏，所以不能说克隆技术是绝无益处的。师（做暂停的动作，学生依然激动万分）：同学们各抒己见，对此提出了不少看法，或许不够深刻，却是朴素而真实的。坦白地说，我在这方面的知识未必比你们高深，你们的发言给了我启发。克隆技术取得突破性进展，世界为之轰动，它对我们人类究竟是利大于弊，还是弊大于利呢?现在下结论还为时过早，这篇课文里引用了诺贝尔奖获得者、著名分子生物学家J．D.沃森的话作结束语： "许多生物学家，特别是那些从事无性繁殖研究的科学家，将会严肃地考虑它的含义，并展开科学讨论，用以教育世界人民。"，这也正是我们所期待的，我们希望"克隆技术造福人类" 。关于基因工程的发展、现状、应用的论文！基因工程技术的现状和前景发展【摘要】从20世纪70年代初发展起来的基因工程技术，经过30多年来的进步与发展，已成为生物技术的核心内容。许多科学家预言，生物学将成为21世纪最重要的学科，基因工程及相关领域的产业将成为21世纪的主导产业之一。基因工程研究和应用范围涉及农业、工业、医药、能源、环保等许多领域。【关键词】基因工程技术；前景；现状一、基因工程应用于植物方面农业领域是目前转基因技术应用最为广泛的领域之一。农作物生物技术的目的是提高作物产量，改善品质，增强作物抗逆性、抗病虫害的能力。基因工程在这些领域已取得了令人瞩目的成就。由于植物病毒分子生物学的发展，植物抗病基因工程也也已全面展开。自从发现烟草花叶病毒(TMV)的外壳蛋白基因导入烟草中，在转基因植株上明显延迟发病时间或减轻病害的症状，通过导入植物病毒外壳蛋白来提高植物抗病毒的能力，已用多种植物病毒进行了试验。在利用基因工程手段增强植物对细菌和真菌病的抗性方面，也已取得很大进展。植物对逆境的抗性一直是植物生物学家关心的问题。由于植物生理学家、遗传学家和分子生物学家协同作战，耐涝、耐盐碱、耐旱和耐冷的转基因作物新品种(系)也已获得成功。植物的抗寒性对其生长发育尤为重要。科学家发现极地的鱼体内有一些特殊蛋白可以抑制冰晶的增长，从而免受低温的冻害并正常地生活在寒冷的极地中。将这种抗冻蛋白基因从鱼基因组中分离出来，导入植物体可获得转基因植物，目前这种基因已被转入番茄和黄瓜中。随着生活水平的提高，人们越来越关注口味、口感、营养成分、欣赏价值等品质性状。实践证明，利用基因工程可以有效地改善植物的品质，而且越来越多的基因工程植物进入了商品化生产领域，近几年利用基因工程改良作物品质也取得了不少进展，如美国国际植物研究所的科学家们从大豆中获取蛋白质合成基因，成功地导入到马铃薯中，培育出高蛋白马铃薯品种，其蛋白质含量接近大豆，大大提高了营养价值，得到了农场主及消费者的普遍欢迎。在花色、花香、花姿等性状的改良上也作了大量的研究。二、基因工程应用于医药方面目前，以基因工程药物为主导的基因工程应用产业已成为全球发展最快的产业之一，发展前景非常广阔。基因工程药物主要包括细胞因子、抗体、疫苗、激素和寡核甘酸药物等。它们对预防人类的肿瘤、心血管疾病、遗传病、糖尿病、包括艾滋病在内的各种传染病、类风湿疾病等有重要作用。在很多领域特别是疑难病症上，基因工程工程药物起到了传统化学药物难以达到的作用。我们最为熟悉的干扰素(IFN)就是一类利用基因工程技术研制成的多功能细胞因子，在临床上已用于治疗白血病、乙肝、丙肝、多发性硬化症和类风湿关节炎等多种疾病。目前，应用基因工程研制的艾滋病疫苗已完成中试，并进入临床验证阶段；专门用于治疗肿瘤的“肿瘤基因导弹”也将在不久完成研制，它可有目的地寻找并杀死肿瘤，将使癌症的治愈成为可能。由中国、美国、德国三国科学家及中外六家研究机构参与研制的专门用于治疗乙肝、慢迁肝、慢活肝、丙肝、肝硬化的体细胞基因生物注射剂，最终解决了从剪切、分离到吞食肝细胞内肝炎病毒，修复、促进肝细胞再生的全过程。经4年临床试验已在全国面向肝炎患者。此项基因学研究成果在国际治肝领域中，是继干扰素等药物之后的一项具有革命性转变的重大医学成果。三、基因工程应用于环保方面工业发展以及其它人为因素造成的环境污染已远远超出了自然界微生物的净化能力，已成为人们十分关注的问题。基因工程技术可提高微生物净化环境的能力。美国利用DNA重组技术把降解芳烃、萜烃、多环芳烃、脂肪烃的4种菌体基因链接，转移到某一菌体中构建出可同时降解4种有机物的“超级细菌”，用之清除石油污染，在数小时内可将水上浮油中的2/3烃类降解完，而天然菌株需1年之久。也有人把Bt蛋白基因、球形芽孢杆菌、且表达成功。它能钉死蚊虫与害虫，而对人畜无害，不污染环境。现已开发出的基因工程菌有净化农药的DDT的细菌、降解水中的染料、环境中有机氯苯类和氯酚类、多氯联苯的工程菌、降解土壤中的TNT炸药的工程菌及用于吸附无机有毒化合物(铅、汞、镉等)的基因工程菌及植物等。90年代后期问世的DNA改组技术可以创新基因，并赋予表达产物以新的功能，创造出全新的微生物，如可将降解某一污染物的不同细菌的基因通过PCR技术全部克隆出来，再利用基因重组技术在体外加工重组，最后导入合适的载体，就有可能产生一种或几种具有非凡降解能力的超级菌株，从而大大地提高降解效率。四、前景展望由于基因工程运用DNA分子重组技术，能够按照人们预先的设计创造出许多新的遗传结合体，具有新奇遗传性状的新型产物，增强了人们改造动植物的主观能动性、预见性。而且在人类疾病的诊断、治疗等方面具有革命性的推动作用，对人口素质、环境保护等作出具大贡献。所以，各国政府及一些大公司都十分重视基因工程技术的研究与开发应用，抢夺这一高科技制高点。其应用前景十分广阔。我国基因工程技术尚落后于发达国家，更应当加速发展，切不可坐失良机。但是，任何科学技术都是一把“双刃剑”，在给人类带来利益的同时，也会给人类带来一定的灾难。比如基因药物，它不仅能根治遗传性疾病、恶性肿瘤、心脑血管疾病等，甚至人的智力、体魄、性格、外表等亦可随意加以改造；还有，克隆技术如果不加限制，任其自由发展，最终有可能导致人类的毁灭。还有，尽管目前的转基因动植物还未发现对人类有什么危害，但不等于说转基因动植物就是十分安全的，毕竟这些东西还是新生事物，需要实践慢慢地检验。转基因生物和常规繁殖生长的品种一样，是在原有品种的基础上对其部分性状进行修饰或增加新性状，或消除原来的不利性状，但常规育种是通过自然选择，而且是近缘杂交，适者生存下来，不适者被淘汰掉。而转基因生物远远超出了近缘的范围，人们对可能出现的新组合、新性状会不会影响人类健康和环境，还缺乏知识和经验，按目前的科学水平还不能完全精确地预测。所以，我们要在抓住机遇，大力发展基因工程技术的同时，需要严格管理，充分重视转基因生物的安全性。【参考文献】[1]楼士林，杨盛昌，龙敏南，等.基因工程[M].北京：科学出版社，2002.[2]李庆军，董艳桐，施冰.植物抗虫基因的研究进展[J].林业科技，2002，27(2)：22 26. 这还有一篇http://www.lmbe.seu.e.cn/biology/bess/exercise-collection/2001a/gene/dd.htmDNA与蛋白质相互作用的研究方法有哪些在许多的细胞生命活动中，例如DNA复制、mRNA转录与修饰以及病毒的感染等都涉及到DNA与蛋白质之间的相互作用的问题。重组DNA技术的发展，人们已分离到了许多重要的基因。现在的关键问题是需要揭示环境因子及发育信号究竟是如何控制基因的转录活性。为此需要：a、鉴定分析参与基因表达调控的DNA元件；b、分离并鉴定这些顺式元件特异性结合的蛋白质因子；这些问题的研究都涉及到DNA与蛋白质之间的相互作用。研究DNA-蛋白质相互作用的实验方法主要包括：a、凝胶阻滞实验； b、DNase 1 足迹实验；c、甲基化干扰实验； d、体内足迹实验； f、拉下实验。研究蛋白质/核酸相互作用近期采用的新技术有：核酸适体技术、生物信息学方法、蛋白质芯片技术以及纳米技术等。凝胶阻滞实验1、概念：凝胶阻滞实验（Gel retardation assay），要叫做DNA迁移率变动试验（DNA mobility shift assay）或条带阻滞实验（Band retardation assay）是在八十年代初期出现的用于在体外研究DNA与蛋白质相互作用的一种特殊的凝胶电泳技术。2、原理：在凝胶电泳中，由于电场的作用，裸露的DNA分子向正电极移动距离的大小是同其分子量的对数成反比。如果某种DNA分子结合上一种特殊的蛋白质，那么由于分子量的加大它在凝胶中的迁移作用便会受到阻滞，于是朝正极移动的距离也就相应的缩短，因而在凝胶中出现滞后的条带，这就是凝胶阻滞实验的基本原理。3、过程:首先制备细胞蛋白质提取物（理论上其中含有某种特殊的转录因子）用放射性同位素标记待检测的DNA片段（含有转录因子的结合位点）这种被标记的探针DNA同细胞蛋白质提取物一起进行温育，于是产生DNA-蛋白质复合物在控制使DNA-蛋白质保持结合状态的条件下，进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳最后进行放射自显影，分析电泳结果4、实验结果的分析：a、如果有放射性标记的条带都集中于凝胶的底部，这就表明在细胞提取物中不存在可以同探针DNA相互结合的转录因子蛋白质；b、如果在凝胶的顶部出现放射性标记的条带，这就表明细胞提取物存在可与探针DNA结合的转录因子蛋白质。5、DNA竞争实验：DNA竞争实验（DNA competitive assay）的具体做法如下：在DNA-蛋白质结合的反应体系中加入了超量的非标记的竞争DNA（competitor DNA），如果它同探针DNA结合的是同一种转录因子蛋白质，那么由于竞争DNA与探针DNA相比是极大超量的，这样绝大部分转录因子蛋白质都会被竞争结合掉，而使探针DNA仍然处于自由的非结合状态，可以在电泳凝胶的放射自显影图片上就不会出现阻滞的条带；如果反应体系中加入的竞争DNA并不能同探针DNA竞争结合同一种转录因子，结果在电泳凝胶中的放射自显影图片上就会出现阻滞的条带。6、应用：a、凝胶阻滞实验可以用于鉴定在特殊类型细胞蛋白质提取物中，是否存在能同某一特定的DNA（含有转录因子结合位点）结合的转录因子蛋白质；b、DNA竞争实验可以用来检测转录因子蛋白质同DNA结合的精确序列部位；c、通过竞争DNA中转录因子结合位点的碱基突变可以研究此种突变竞争性能及其转录因子结合作用的影响；d、也可以利用DNA同特定转录因子的结合作用通过亲和层析来分离特定的转录因子。DNaseI足迹实验1、定义:足迹实验（foot-printing assay），是一种用来检测被特定转录因子蛋白质特异性结合的DNA序列的位置及其核苷酸序列结构的专门实验方法。2、原理：当DNA分子中的某一区段同特异的转录因子结合之后便可以得到保护而免受DNaseI 酶的切割作用，而不会产生出相应的切割分子，结果在凝胶电泳放射性自显影图片上便出现了一个空白区，俗称为“足迹” 。3过程：将待检测的双链DNA分子在体外用32P作5‘末端标记，并用适当的限制性内切酶切出其中的一个末端，于是便得到了一条单链末端标记的双链DNA在体外同细胞蛋白质提取物（细胞核提取物也可以）混合，形成DNA-蛋白质复合体在反应混合物中加入少量的DNase I,并控制用量使之达到平均每条DNA链，只发生一次磷酸二酯键的断裂：a、如果蛋白质提取物中不存在与DNA结合的特定蛋白质，使DNase I消化之后，便会产生出距离放射性标记末端1个核苷酸，2个核苷酸，3个核苷酸------等等一系列前后长度均相差一个核苷酸的不间断的连续的DNA片段梯度群体；b、如果DNA分子同蛋白质提取物中的某种转录因子结合，被结合部位的DNA就可以得到保护免受DNase I酶的降解作用；除去蛋白，加样在20%序列胶上进行电泳分离，实验分两组:a、实验组：DNA+蛋白质混合物b、对照组：只有DNA，未与蛋白质提取物进行温育最后进行放射性自显影，分析实验结果。4、结果判断:实验组凝胶电泳显示的序列，出现空白的区域表明是转录因子蛋白质结合部；与对照组序列比较，便可以得出蛋白质结合部位的DNA区段相应的核苷酸序列。5、其他的足迹实验方法：除了DNase1足迹试验之外，目前还发展出了若干种其他类型的足迹实验，例如：a、自由羟基足迹实验；b、菲咯啉铜足迹实验；c、DMS(硫酸二甲酯)足迹实验DMS(硫酸二甲酯)足迹实验的原理DMS能够使DNA分子中裸露的鸟嘌呤（G）残基甲基化，而六氢吡啶又会对甲基化的G残基作特异性的化学切割。如果DNA分子中某一区段同转录因子结合，就可以避免发生G残基的甲基化而免受六氢吡啶的切割作用。甲基化干扰实验1、概念：甲基化干扰实验（Methylation interference assay）是根据DMS（硫酸二甲酯）能够使DNA分子中裸露的鸟嘌呤（G）残基甲基化，而六氢吡啶又会对甲基化的G残基作特异性的化学切割这一原理设计的另一种研究蛋白质同DNA相互作用的实验方法。应用这种技术可以检测靶DNA中G残基的优先甲基化，对尔后的蛋白质结合作用究竟会有什么效应，从而更加详细的揭示出DNA与蛋白质相互作用的模式。2、实验步骤：用DMS处理靶DNA使之局部甲基化（平均每条DNA只发生一个G碱基甲基化作用）同细胞蛋白质提取物一起进行温育，促进使DNA与蛋白质的结合进行凝胶电泳形成两种靶DNA条带：a、其一没有同蛋白质结合的DNA正常电泳条带b、其二同特异蛋白质结合而呈现滞后的DNA电泳条带将这两种DNA电泳条带分别从凝胶中切出，并用六氢吡啶进行切割，结果为：a)、甲基化的G残基被切割:因为转录因子蛋白质只能够同未发生甲基化的正常的结合位点结合，所以在转录因子DNA结合位点序列中的G残基如果被DMS甲基化之后，转录因子就无法同其结合位点（顺式元件）发生结合作用，从而使得结合位点中的G残基同样也要被六氢吡啶切割；b)、不具有甲基化G残基的靶DNA 序列则不会被切割将结合蛋白质的DNA条带和不结合蛋白质的DNA条带，经六氢吡啶切割作用之后，再进行凝胶电泳作放射自显影，读片并分析结果3、结果判断：a、同转录因子蛋白质结合的靶DNA序列，经六氢吡啶切割之后，电泳分离呈现两条带，有一个空白区b、不同转录因子蛋白质结合的靶DNA序列，经六氢吡啶切割后，电泳分离呈现三条带，没有空白区域的出现。4、应用：a、甲基化干扰实验可以用来研究转录因子与DNA结合位点中的G残基之间的联系；b、是足迹实验的一种有效的补充手段，可以鉴定足迹实验中DNA与蛋白质相互作用的精确位置5、缺点：DMS只能使DNA序列中的G和A残基甲基化，而不能使T和C残基甲基化。体内足迹实验上面讨论的三种研究转录因子与DNA相互作用的方法，有一个共同的不足之处在于它们是在体外进行的实验，因此人们就会考虑这些实验结果是否能够反映细胞内发生的真实生命过程，即细胞内发生的真实的DNA与蛋白质的相互作用情况。为了解答这个问题，科学家就设计出了一种体内足迹试验（in vivo foot-printing assay），该方法可以看做是体外DMS足迹实验的一个变种。1、原理：体内足迹试验的原理原则上同体外DMS足迹实验无本质差别，即a、DMS能够使G残基甲基化；b、六氢吡啶能特异的切割甲基化的G残基；c、同特异转录因子蛋白质结合的识别序列中的G残基由于受到蛋白质的保护而不会被DMS甲基化，于是不会被六氢吡啶切割；d、同对照的裸露的DNA形成的序列梯作比较，就会发现活细胞DNA形成的序列梯中缺少G残基没有被切割的相应条带。2、过程：用有限数量的化学试剂DMS处理完整的游离细胞，使渗透到胞内的DMS浓度恰好导致天然染色体DNA的G残基发生甲基化对这些经过DMS处理的细胞提取DNA，并在体外加入六氢吡啶作消化反应PCR扩增后作凝胶电泳分析，因为在体外实验中用的是克隆的DNA片段其数量足够，而在体内足迹实验中用的是从染色体DNA中分离获得的任何一种特异的DNA，其数量是微不足道的，所以需要经PCR扩增以获得足够数量的特异DNA放射自显影，读片并记录读片的结果3、结果判断：a、能够同转录因子蛋白质结合的DNA区段其中G残基受到保护因而不会被DMS甲基化避免了六氢吡啶的切割作用；b、体外裸露的DNA分子上，G残基被DMS甲基化而被六氢吡啶切割。拉下实验（Pull-down assay）拉下实验又叫做蛋白质体外结合实验（binding assay in vitro），是一种在试管中检测蛋白质之间相互作用的方法。其基本原理是将某种小肽（例如生物素、6-His标签以及谷胱甘肽转移酶等）的编码基因与诱饵蛋白的编码基因重组，表达为融合蛋白。分离纯化融合蛋白并与磁珠结合，使之固相化之后，再与表达目的蛋白的细胞提取物混合保温适当时间，例如在4℃下保温过夜，使目标蛋白同已经固定在磁珠表面的融合蛋白中的诱饵蛋白充分的结合。离心收集与固定化的融合蛋白（即与磁珠相互结合的融合蛋白）中的诱饵蛋白相结合的目的蛋白，经过煮沸处理使目的蛋白与诱饵蛋白相脱离从而从固相支持物（例如磁珠）上脱离下来，收集样品，再与目标蛋白的抗体作Western blotting分析，以检测出与诱饵蛋白的目标的目标蛋白。一些新的研究蛋白质/核酸相互作用的方法和技术，主要从核酸适体技术、生物信息学方法、蛋白质芯片技术以及纳米技术等方面进行综述。核酸适体技术核酸适体(aptamer)指的是经过一种新的体外筛选技术——指数富集配体系统进化(systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX)，从随机单链寡聚核苷酸文库中得到的能特异结合蛋白质或其他小分子物质的单链寡聚核苷酸，可以是RNA 也可以是DNA，长度一般为25~60 个核苷酸。SELEX 的筛选流程首先是利用现有的分子生物学技术人工合成一个含有1014~1015 个单链寡核苷酸序列的随机文库，序列长度往往在25~35 个核苷酸之间，单链的随机寡核苷酸序列容易形成可与蛋白质等配体特异性共价结合的二级结构，在这一高亲和力特异性结合的基础之上配体蛋白质同随机文库相互作用，选择性分离出核酸适体后，然后通过PCR或RT-PCR 等技术进行扩增。次一级文库再与配体蛋白质相互作用，反复多次循环，即可获得与配体蛋白质特异性高亲和力结合的核酸适体。核酸适体与配体间的亲合力(解离常数在皮摩和纳摩之间)常要强于抗原抗体之间的亲合力[3] 。核酸适体所结合的靶分子范围非常广泛，除蛋白质之外，还能作用于酶、生长因子、抗体、基因调节因子、细胞黏附分子、植物凝集素、完整的病毒颗粒、病原菌等[4] 。适体从20 世纪90 年代初出现以后，就得到了科研工作者的广泛关注，适体的研究工作得到了快速的发展。SELEX 筛选技术和核酸适体的高亲和性在蛋白质/核酸相互作用的研究中发挥了重要的作用。Wen等[5]研究了同细菌噬菌体Ff 基因5蛋白(g5p) 高亲和力结合的核酸适体，发现G 富集基序对于形成g5p 连接启动子结构，提供实际的g5p 连接位点具有重要的意义。White 等[6]利用SELEX 技术研究了一种PUM2HD (短小杆菌素同源结构域)及其RNA 核酸适体，发现在PUM2 氨基端有Ser和Glu/Ala富集区，并且PEB ( PUM2 连接元件)与果蝇反应元件的3"端具有亲缘关系，但又互不相同。Bouvent等[7]利用NRE(核仁蛋白识别元件) 发现了RNA 茎环上的RBD1 和RBD2 (折叠元件结构域)，这对了解模式蛋白识别RNA 的结构过程具有重要意义。核酸适体以及SELEX 技术给蛋白质/核酸相互作用研究提供了一种新颖的研究方法，科研人员可以控制筛选条件得到与待研究蛋白质相互结合的核酸适体，避免了天然条件下研究蛋白质/核酸相互作用的困难性。但目前对核酸适体与靶蛋白相互作用的分析是在筛选条件与天然条件相同的假设基础上进行的，在这种筛选条件下得到的核酸适体与蛋白质之间的相互作用，和天然状态下的蛋白质/核酸之间的相互作用到底有何异同，这是一个亟待解决的问题，此问题的解决必将推动蛋白质/核酸相互作用的研究进展。生物信息学方法生物信息学是在生命科学的研究中，以计算机为工具对生物信息进行储存、检索和分析的科学。它包含着生物信息的获取、处理、存储、分配、分析和解释的所有方面。具体地说，生物信息学是用数理和信息科学的观点、理论和方法去研究生命现象，组织和分析呈现指数增长的生物学数据的一门学科。Luscombe和Thornton[8]利用氨基酸序列的保守性构建计算机算法来预测蛋白质/DNA复合体中DNA的结合位点。Selvaraj等[9]将蛋白质/核酸复合体中原子电荷势能作为训练数据集，利用人工智能技术来预测蛋白质对DNA 的识别位点。Ahmad 等[10]将蛋白质的序列组成、可溶解性以及二级结构等信息数据用人工神经网络算法进行训练，构建了在线蛋白质/核酸结合预测技术，预测成功率达到了69% 。此后Ahmad 和Sarai[11]将此技术进一步加强，在训练人工神经网络时加入了蛋白质进化关系的信息，使预测成功率提高了8.7% 。目前建立在蛋白质/核酸相互作用基础上的较重要的数据库为蛋白质- 核酸识别数据库(http://gibk26.bse.kyutech.ac.jp/jouhou/3dinsight/recognition.html)，利用该数据库能帮助研究者了解核酸被蛋白质识别的机制。该数据库包括以下几个组成部分。2.1　蛋白质-核酸复合物数据库　蛋白质-核酸复合物数据库是一个包含蛋白质- 核酸复合物结构数据的数据库。这些数据根据蛋白质的识别序列和复合物中DNA 形式进行分类。使用者可以通过关键词、识别序列、D N A 形式等进行搜索，并且搜索结果可以直接链接到3DinSight数据库(在此处，可以通过三维结构浏览器，如RasMol 或者VRML 查看含有序列位点和突变位点的三维结构图) 。该数据库也能让使用者检测依赖于序列的构象参数和DNA 的柔韧性，并以图表形式显示结果。2.2　核苷酸-氨基酸相互作用数据库　核苷酸-氨基酸相互作用数据库搜集核苷酸和氨基酸间4 埃大小内的成对原子，能让使用者找到成对的核苷酸和氨基酸。使用者可以指定残基名称( 核苷酸或氨基酸)、原子类型和侧链/骨干。搜索后，带有距离值的所有原子对将被显示。搜索可直接链接到3DinSight 数据库，以RasMol 图片形式自动地突出展示复合物结构中所有原子对。使用者可以检测到每个结构中核苷酸和氨基酸的特别相互作用。2.3　蛋白质-核酸相互作用的热力学数据库(ProNIT)蛋白质- 核酸相互作用的热力学数据库包含有序列、结构和一些热力学参量(如分裂常数、结合常数、吉布斯自由能的转换、焓和热容量、活性)等信息。该数据库允许使用者用不同条件(多种分类和显示选项)搜索数据。此外，ProNIT 超链接于其他重要的数据库，如PDB、核酸数据库NDB 、酶代码EC、蛋白质信息资源PIR 和ProTherm 等等。当前，在分子生物学和信息科学快速发展的影响下，生物信息学已经成为生物领域的指导科学，利用生物信息学方法研究蛋白质/核酸相互作用可以大大缩短研究工作的时间，达到事半功倍的效果。但受限于当前计算科学和算法领域的发展情况，生物信息学得到的结果与实际的结果还存在一定的偏差，仍需开展进一步的实验工作来进行验证。生物芯片技术　生物芯片技术是基于生物大分子间相互作用的大规模并行分析方法，使得生命科学研究中所涉及的样品反应、检测、分析等过程得以连续化、集成化和微型化，现已成为当今生命科学研究领域发展最快的技术之一。目前的生物芯片主要有核酸芯片、蛋白质芯片和糖体芯片等几大类。蛋白质芯片是依靠手工、压印或喷墨的方法将探针蛋白点样在化学膜、凝胶、微孔板或玻片上形成阵列，经过与样品的杂交捕获靶蛋白，再用原子力显微镜、磷光成像仪、光密度仪或激光共聚焦扫描仪进行检测，获得靶蛋白表达的种类、数量及关联等信息。蛋白质芯片已经广泛用于研究蛋白质与核酸的相互作用，已成为一种进行高通量蛋白质与DNA 或RNA作用筛选的有效方法。Ge[12]运用蛋白质芯片检测蛋白质与核酸相互作用，他将包括通用转录因子、激活蛋白和辅激活蛋白在内的48种纯化蛋白质点样在硝酸纤维素膜制成通用蛋白质芯片，用腺病毒主要晚期启动子64 bp 双链DNA 片段、腺病毒主要晚期启动子64 bp 负链DNA 和SV40 早期前体mRNA 杂交，结果证明蛋白质芯片上的所有蛋白质都能够不同程度地特异性识别和结合双链和单链寡核苷酸片段，并且结合双链DNA 和单链DNA 的总体模式基本相同，说明大多数D N A 结合蛋白既能和双链DNA 结合，也能够和单链DNA 结合。蛋白质芯片与RNA 的作用研究表明，蛋白质芯片能够成功地分析RNA 与蛋白质间的识别性结合。蛋白质芯片技术最大优点在于快速和高通量，以往科研人员作研究时一次只能研究少量生物样品，借助蛋白质芯片，一次实验可同时研究大量生物样本，加速了蛋白质/核酸相互作用的研究。蛋白质芯片技术目前存在的问题有：(1)蛋白质芯片在制作过程中实验条件发生微小的变化便可能引起最后结果的不同，实验条件不易控制，使得实验结果的可重复性相对不足；(2) 目前用于蛋白质芯片制备的固相介质，如化学膜、凝胶和玻片都存在一些缺点，蛋白质在固相基质表面的固定往往会造成其解折叠，从而失去生物活性；(3)对结果的扫描、去除背景、数据处理等，目前还不能做得很完美，会导致假阳性、假阴性的存在。纳米技术纳米技术(nano scale technology) 是一门在0.1~100nm 空间尺度内操纵原子和分子，对材料进行加工、制造具有特定功能的产品、或对某物质进行研究，掌握其原子和分子的运动规律和特性的崭新高技术学科。核酸和蛋白质等生物大分子的大小也是在纳米尺度，随着科学技术的快速发展，越来越多的纳米技术被用来研究生物大分子。在蛋白质/核酸相互作用的研究工作中，目前使用较新的技术是利用纳米孔技术来进行研究。纳米孔(nanopore)，可以简单地定义为内径为1~100nm 的微小洞孔，一般孔径应大于洞孔深度，或者处于同一量级。如果孔的深度远大于孔径，就称之为纳米孔道。纳米孔有天然存在的生物纳米孔，也有人工加工的纳米孔。它们都可以用来进行生命科学的相关研究，但是，理想的生物化学或生物物理研究应采用孔径稳定、坚固耐用、物化性能良好的固体纳米孔，这样的纳米孔应该由质地坚硬的固体薄膜材料加工制作。Li等[16]利用聚焦离子束(FIB)制作纳米孔，利用纳米孔将双螺旋DNA 从组蛋白八聚体上剥离下来，并探测这一过程，从而可以揭示核小体中包含的许多生物化学、物理信息。这是由于处于电场中的核小体在电场的作用下，DNA 分子穿越纳米孔，同时由于纳米孔的阻挡力，使组蛋白不能穿越，从而诱使DNA 从组蛋白八聚体上分离下来。通过准确检测DNA 分子穿孔过程中引起的电流阻塞效应，可将DNA 与组蛋白的相互作用的一些性质反映出来。目前已经取得了阶段性的成果。在纳米尺度上研究核酸与蛋白质相互作用，相较于其他的研究方法，优点是能够在生物活性环境中，保持生物大分子受到最少化学修饰干扰的状态下，对生物大分子的空间结构、动态变化、生化特性等进行直接研究。相信该技术可以提供更多、更详细的生物大分子相互作用、蛋白质功能等方面的信息，帮助我们解决一些深层次的生物学疑难问题。目前阻碍此方法广泛应用的一个最大难题是如何在纳米尺度上更好的操纵生物大分子，这需要生物科学、电子科学、材料科学等多学科的共同进展来推动此方法的发展和应用。有谁能告诉我，基因工程概况，基因工程研究现状与进展，基因工程的应用，基因工程的发展前景，速求基因工程是生物工程的一个重要分支，它和细胞工程、酶工程、蛋白质工程和微生物工程共同组成了生物工程。所谓基因工程（genetic engineering)是在分子水平上对基因进行操作的复杂技术。是将外源基因通过体外重组后导入受体细胞内，使这个基因能在受体细胞内复制、转录、翻译表达的操作。它是用人为的方法将所需要的某一供体生物的遗传物质——DNA大分子提取出来，在离体条件下用适当的工具酶进行切割后，把它与作为载体的DNA分子连接起来，然后与载体一起导入某一更易生长、繁殖的受体细胞中，以让外源物质在其中“安家落户”，进行正常的复制和表达，从而获得新物种的一种崭新技术。它克服了远缘杂交的不亲和障碍。前景科学界预言，21世纪是一个基因工程世纪。基因工程是在分子水平对生物遗传作人为干预，要认识它，克隆羊我们先从生物工程谈起：生物工程又称生物技术，是一门应用现代生命科学原理和信息及化工等技术，利用活细胞或其产生的酶来对廉价原材料进行不同程度的加工，提供大量有用产品的综合性工程技术。生物工程的基础是现代生命科学、技术科学和信息科学。生物工程的主要产品是为社会提供大量优质发酵产品，例如生化药物、化工原料、能源、生物防治剂以及食品和饮料，还可以为人类提供治理环境、提取金属、临床诊断、基因治疗和改良农作物品种等社会服务。生物工程主要有基因工程、细胞工程、酶工程、蛋白质工程和微生物工程等5个部分。其中基因工程就是人们对生物基因进行改造，利用生物生产人们想要的特殊产品。随着DNA的内部结构和遗传机制的秘密一点一点呈现在人们眼前，生物学家不再仅仅满足于探索、提示生物遗传的秘密，而是开始跃跃欲试，设想在分子的水平上去干预生物的遗传特性。美国的吉尔伯特是碱基排列分析法的创始人，他率先支持人类基因组工程如果将一种生物的DNA中的某个遗传密码片断连接到另外一种生物的DNA链上去，将DNA重新组织一下，不就可以按照人类的愿望，设计出新的遗传物质并创造出新的生物类型吗？这与过去培育生物繁殖后代的传统做法完全不同，它很像技术科学的工程设计，即按照人类的需要把这种生物的这个“基因”与那种生物的那个“基因”重新“施工”，“组装”成新的基因组合，创造出新的生物。这种完全按照人的意愿，由重新组装基因到新生物产生的生物科学技术，就被称为“基因工程”，或者称之为“遗传工程” 。【简述重组dna技术的基本过程 dna重组技术的研究综述】