无路难开路更难：绿色荧光蛋白的传奇发现之旅( 二 ) 绿色荧光蛋白能够通过自身催

又经历了一个多世纪的徘徊不前，生物发光的化学机理探索由法国生理学教授杜勃瓦(RaphaelDubois)带来新的转折点。在1885年的一个实验中，杜勃瓦先用冷水将叩头虫(Pyrophorus)的发光组织在试管里匀浆，发现抽提物在短暂发光后变暗。他用沸水取得的组织抽提物则完全不发光，令他惊讶的是，当冷却的热水抽提物被加入已经停止发光的冷水抽提物时，混合物居然再度发光(图3) 。若想让冷水抽提物持续发光，杜勃瓦就需要不断补加冷却的热水抽提物。

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图3：杜勃瓦1885年首先发现“萤光素-萤光素酶”生物发光原理的著名实验[Pieribone,V.&Gruber,D.F.(2005)AglowintheDark:TheRevolutionaryScienceofBiofluorescence,BelknapHarvard.]
杜勃瓦随后在其它包括萤火虫在内的发光生物中得到了相似的实验结果，于是他得出了两个重要结论：(1)生物发光的反应除了氧气之外，至少还需要两个化学组分；(2)发光反应中的“燃料”组分可以耐受沸水的高温，而“点燃剂”或催化剂不耐热。杜勃瓦决定借用来自罗马神话的拉丁词Lucifer(字面意思是“光之使者”)来命名这两个组分：不耐热的催化剂名为萤光素酶(luciferase) ，而耐热的小分子则名为萤光素(法语：luciferine ，英语：luciferin) 。
很多生物学家的后续研究表明：对于很多发光物种而言，萤光素酶有不同的蛋白序列，而萤光素也呈现多样化的有机小分子结构，但“萤光素-萤光素酶”的生物发光原理都是成立的。生物发光研究者的目标也就可以具体化，选择一个感兴趣的发光物种，用生物化学手段来分离纯化不同的萤光素和萤光素酶。通过对萤火虫发光系统的深入研究，科学家们很快又发现在氧气、萤光素、萤光素酶之外， ATP和Mg2+离子也是必要条件(图3) 。
生物发光对于陆生物种而言并不常见，而在深海里却有超过90%的海洋生物能够发光。从海平面每往下75米，阳光的强度就要减弱10倍。在阳光无法到达的深度以下，会发光的动物在寻找食物、逃避敌害和吸引配偶上拥有明显的优势。在大致阐明萤火虫的发光机理之后，很多科学家就把目光转向海洋发光生物，其中最有名的就是美国普林斯顿大学开宗立派的哈维教授(E.NewtonHarvey) 。
1916年，时年28岁的哈维携夫人前往日本蜜月旅行。三崎临海实验所附近的海域适合两人在夜间游泳，哈维在畅游之余迷上了一种叫做希氏弯喉海萤(Vargulahilgendorfii,曾用属名Cypridina)的发光海洋生物。海萤在采集和抽干后可以长期保存，用水濡湿后又能发光，因此被哈维视为用生物化学手段研究生物发光的最佳实验材料。哈维实验室发现海萤的发光系统比萤火虫要简单，只需萤光素、萤光素酶、氧气，而无需ATP和Mg2+离子(图4) 。但哈维团队在部分纯化了海萤的萤光素之后，努力钻研了二十多年也无法获得其结晶。而没有高纯度的萤光素，他们就无法通过确定其分子结构来深入研究海萤发光的化学机理。

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图4：希氏弯喉海萤的萤光素-萤光素酶生物发光系统
【无路难开路更难：绿色荧光蛋白的传奇发现之旅】下村修结晶纯化海萤的萤光素